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Validierung in Zellmodellen

Ziel des Vorhabens ist die Durchführung einer systematischen funktionellen Validierung von genetischen Vorhersagemodellen des Morbus Parkinson (MP) zu Pathway- und Netzwerk-Dysregulation in zellulären Modellen, die aus Biomaterial von Patienten generiert wurden. Die wesentlichen Untersuchungen konzentrieren sich auf verschiedene Aspekte mitochondrialer Dysfunktion, um eine Patientengruppe mit MP zu stratifizieren, bei denen eine mitochondriale Dysfunktion als Erkrankungs(teil-)ursache eine wesentliche Rolle spielt.

Automatisierte Zellkultur mit Geräten zur High-throughput-Analyse. Die Abbildung zeigt ein automatisiertes Labor mit Zellkultur und Geräten für High-throughput-Analysen bei unserem Projektpartner an der Universität Tübingen (www.dzne.de/standorte/tuebingen/forschergruppen/jain.html).

Die gezielte (low throughput) Validierung der mitochondrialen Funktion (z. B. mitochondriales Membranpotential, Morphologie und Integrität des mitochondrialen Genoms) in Fibroblasten und Neuronen generiert aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Patienten wird die erste Stufe der Analysen darstellen. Dafür werden Zellen von Patienten mit MP-assoziierten Mutationen in Parkin oder PINK1 als Referenz verwendet, um sie mit Zellen von idiopathischen Patienten mit zuvor identifizierten deregulierten mitochondrialen Pathways zu vergleichen und einen postulierten mitochondrialen Phänotyp zu validieren.
Die zweite Stufe der Validierung wird diese Analysen in High-throughput-Ansätze übertragen. Wir werden sowohl morphologische (z. B. Neuritenwachstum, mitochondriale Funktion, Morphologie) als auch genomische Phänotypen (z. B. Genomweite RNA-Expression) verwenden. Um für die vorhergesagten Effekte von multiplen Risikofaktoren beim MP ein Modell zu generieren, werden wir mittels Knock-down und Überexpression gleichzeitig Stressbedingungen in den Zellen der Patienten induzieren.
Die dritte Stufe der Validierung wird den Bereich der Proteomic-Analyse abdecken. Netzwerk-Daten von Protein-Interaktionen werden mittels quantitativer Analyse von isolierten Mitochondrien aus iPS-Zelllinien generiert. Darauf aufbauend sollen aus den funktionell in Beziehung stehenden Protein-Clustern Proteine ausgewählt werden, die mit großer Wahrscheinlichkeit an dem postulierten Phänotyp beteiligt sind.
Das Ziel ist die Validierung der identifizierten “Hauptakteure” und die genaue Analyse des krankheitsspezifischen Netzwerkes, um mit den etablierten High-throughput-Zellassays ein Tool für die Identifizierung potentieller Wirkstoffe zur Verfügung zu stellen.