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Transcriptomics by RNA-sequencing: Performing and reporting in clinical routine

Genexpressionsanalysen (gene expression profiling, GEP), am häufigsten unter Verwendung von Affymetrix U133 2.0 DNA-Microarrays, erlauben die simultane Erfassung der Expression (fast) aller Gene ohne die Notwendigkeit einer Präselektion und stellen somit die erste „Omics“-Methode dar, die in der klinischen Routine beim Multiplen Myelom eingesetzt wird. GEP erlaubt: i) Eine Risikostratifikation, ii) die molekulare Diagnose im Sinne der molekularen Klassifikation, durch die das Multiple Myelom in unterschiedliche Subentitäten eingeteilt werden kann, iii) die Erfassung der Surrogate biologischer Variablen, die ebenfalls prognostische Relevanz haben (z.B. Proliferation), und iv) die Erfassung potentieller therapeutischer Zielgene (z.B. Aurora-Kinase A). Wie von unserer Gruppe gezeigt, kann GEP in multizentrischen Studien bei ≥ 80% der Patienten durchgeführt und innerhalb von 4-6 Wochen unter Verwendung unseres nicht-kommerziellen open-source Genexpressionsreportes GEP-R (http://code.google.com/p/gep-r) in der klinischen Routine reportiert werden (s. Abbildung). Die RNA-Sequencing (RNA-Seq) ist eine neue Methode zum Erfassen des Transkriptoms, welche sog. „Deep-sequencing”-Technologien nutzt. RNA-Seq hat gegenüber der GEP fünf Hauptvorteile:  1) sie ermöglicht eine präzisere Quantifizierung von Transkripten ohne signifikante Sättigungseffekte, 2) sie setzt keine a priori Definition von zu analysierenden Sequenzen voraus (wie z.B. bei den sog. Affymetrix “Probesets”) und erlaubt dementsprechend auch die Erfassung von mutierten Transkripten (z.B. BRAF-Mutationen). Auch für Transkripte, für die ursprünglich eine fehlerhafte Sequenz angenommen wurde und dementsprechend korrespondierende Probesets nicht das betreffende Transkript interrogieren (z.B. ErbB-Rezeptoren auf Affymetrix DNA-Microarrays), ist eine Analyse möglich. 3) RNA-Seq kann mit sehr geringen RNA-Mengen durchgeführt werden (1 ng vs. 100 ng für GEP bei Doppelamplifikation). 4) RNA-Seq erlaubt die Analyse von Splicevarianten, und 5) die Untersuchung anderer RNAs (insbesondere kleiner RNAs, z.B. miRNA).
Ziel des vorliegenden Teilprojekts ist i) die Durchführung und Reportierung einer auf RNA-Sequenzierung beruhenden Prädiktion des Überlebens sowie die Ausgabe therapeutischer Zielstrukturen und biologischer Variablen (z.B. Proliferation) auf Basis unseres GEP-R sowie ii) die Untersuchung neuer „therapierbarer“ Aberrationen in einer Subfraktion von Patienten mit dem Ziel einer personalisierten „add-on“-Therapie.

Genexpressionsreport auf Basis von DNA-Microarrays als Vorlage für den im Rahmen des Teilprojektes zu erstellenden Sequenzierungsreport.
Der Genexpressionsreport (GEP-R) ist eine nicht-kommerzielle, adaptierbare  Softwareoberfläche, welche die molekularen Klassifikationen, Risikostratifikationen sowie die Erfassung von Zielgenen, z.B. AURKA, FGFR3, IGF1R, oder MAGEA3 zur risikoadaptierten bzw. personalisierten Therapie in einen Befund integriert. Zudem wird eine Identitäts- sowie Qualitätskontrolle durchgeführt und der Befund anschließend als pdf-Dokument ausgegeben. Um die Anwendung in der klinischen Praxis zu erleichtern, werden validierte klinische und genexpressionsbasierte Risikofaktoren in einem überlegenen Metascore (HM-Metascore) zusammengefasst, der es dem Arzt erlaubt, eine zusammenfassende prognostische Abschätzung abzugeben.